噬菌體載體

目錄: 1、種類; 2、λ類噬菌體載體; 3、M13噬菌體載體

種類

噬菌體主主要有雙鏈噬菌體和單鏈絲狀噬菌體兩大類。雙鏈噬菌體為λ類噬菌體，單鏈絲狀噬菌體有M13、f1、fd噬菌體。重組DNA技術(shù)中常用的噬菌體克隆載體主要有λ類噬菌體和M13噬菌體。

λ類噬菌體載體

構(gòu)建λ噬菌體載體的基本原理是多余限制位點的刪除。

按照這一基本原理構(gòu)建的λ噬菌體的派生載體，可以歸納成兩種不同的類型：

一種是插入型載體(insertionvectors)，只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點。

另一種是替換型載體(rePlacementvectors)，具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的人DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。

在基因克隆中的二者的用途不盡相同。插入型載體只能承受較小分子量(一般在10kb以內(nèi))的外源DNA片段的插入，廣泛應用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替換型載體則可承受較大分子量的外源DNA片段的插入，所以適用于克隆高等真核生物的染色體DNA。

主要類型

(i)插入型載體

外源的DNA克隆到插入型的λ載體分子上，會使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應。插入型的λ載體又可以分為免疫功能失活的(inactivatiortofimmunityfunction)和大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活的(inactlvatlonofE.coliβ-galactosidase)兩種亞型。

①免疫功能失活的插入型載體：在這類插入型載體的基因組中有一段免疫區(qū)，其中帶有一兩種核酸內(nèi)切限制酶的單切割位點。當外源DNA片段插入到這種位點上時，就會使載體所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破壞，而不能進入溶源周期。因此，凡帶有外源DNA插入的λ重組體都只能形成清晰的噬菌斑，而沒有外源DNA插入的親本噬菌體就會形成混濁的噬菌斑。

②β-半乳糖苷酶失活的插入型載體：它們的基因組中含有一個大腸桿菌的lac5區(qū)段，其中編碼著β半乳糖著酶基因lacZ。由這種載體感染的大腸桿菌lac-指示菌，涂布在補加有IPTG和Xgal的培養(yǎng)基平板上，會形成藍色的噬菌斑。如果外源DNA插入到lac5區(qū)段上，阻斷了β-半乳糖著酶基因lacZ的編碼序列，不能合成β-半乳糖昔酶，只能形成無色的噬菌斑。

(ii)替換型載體

替換型載體又叫做取代型載體(substitutionvector)，是一類在λ噬菌體基礎上改建的、在其中央部分有一個可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆載體。

λNM781便是其中的一個代表。在這個替換型載體中，可取代的EcoRI片段，編碼有一個supE基因(大腸桿菌突變體tRNA基因),由于這種λNM781噬菌體的感染，寄主細胞lacZ基因的琥珀突變更被抑制了，能在乳糖麥康基氏(MacConkey)瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出紅色的噬菌斑，或是在Xgal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出藍色的噬菌斑。如果這個具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重組體噬菌體，在上述這兩種指示培養(yǎng)基上都只能產(chǎn)生出無色的噬菌斑。

用替換型載體克隆外源DNA包括三個步驟：

第一，應用適當?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶消化λ載體，除去基因組中可取代的DNA區(qū)段。

第二，將上述所得的人DNA臂同外源DNA片段連接。

第三，對重組體的λDNA分子進行包裝和增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體。